Введение

Миотоническая дистрофия (МД) Россолимо-Куршманна-Штейнерта-Баттена представляет собой наследственное нейромышечное заболевание, которое характеризуется мультисистемностью поражения с широкой вариабельностью клинических проявлений, основными из которых являются миотония, миопатия, катаракта, кардиомиопатия, эндокринные нарушения, в тяжелых случаях психоневрологические отклонения. Частота ее составляет в среднем  по миру 12,5 на 100 тыс. населения [1, 2].  МД широко распространена в популяциях Европы и Азии. По данным Коротова М.Н., Кузьминой З.М.[3], Ноговицыной А.Н.[4] в якутской популяции наблюдается высокое накопление МД. В Республиканском генетическом регистре МГК среди наследственных болезней нервной системы миотоническая дистрофия занимает второе место по частоте после спиноцеребеллярной атаксии I типа.

Ген, ответственный за развитие МД,  локализуется на хромосоме 19 в области q13.2- 13.3 и кодирует синтез белка миотонинпротеинкиназы. Миотоническая дистрофия  –  заболевание, возникающее в результате мутации «динамического» типа: у больных имеет место экспансия тандемных тринуклеотидных повторов CTG (цитозин-тимин-гуанин). У здоровых людей число CTG-повторов варьирует от 5 до 37 [5], тогда как на мутантных хромосомах число этих повторов увеличено в десятки и сотни раз (до 4000). Существует тесная корреляция между числом CTG-повторов и началом проявления, а также степенью тяжести заболевания: больные с небольшой степенью экспансии триплетов (40-160 копий) имеют минимальные клинические проявления, например, только катаракту в качестве единственного симптома. Больные с развернутой клинической картиной имеют большее число копий триплетов. Наибольшая степень экспансии отмечена при врожденной форме МД. В семьях с МД характерным является феномен антиципации – манифестация более тяжелых и все более ранних форм болезни в каждом последующем поколении.  Причиной антиципации является генетическая нестабильность мутантного тринуклеотидного сегмента. Нестабильность СТG-повтора выше при передаче гена по материнской линии, поэтому врожденная форма МД наблюдается исключительно при рождении от больных матерей [5,6,7,8]. В редких случаях наблюдается уменьшение длины мутантного повтора у потомков, что сопровождается развитием более легкой клинической картины или асимптомным течением. Такие случаи наблюдаются при отцовской передаче гена [6].

Существуют популяционные различия как по числу CTG-повторов в норме и патологии, так и по частоте и характеру проявления самого заболевания. Целью данной работы является анализ популяционных особенностей МД в РС(Я) для разработки подходов к ДНК-тестированию при медико-генетическом консультировании больных.

 

  Материалы и методы

Клинико-генеалогический анализ проведен в 29 якутских семьях, отягощенных МД (58 больных с клиническим диагнозом «миотоническая дистрофия» и 78 их клинически здоровых родственников из группы риска) [9].

Для анализа нормального полиморфизма CTG-локуса гена МД  в работе  использованы  134 образца ДНК якутов — коренных жителей  Республики Саха (Якутия) из центральной и вилюйской группы улусов.  Коллекция составлена из материала БАНКА ДНК Отдела Молекулярной Генетики ЯНЦ РАМН и Правительства РС(Я).

ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови стандартным методом [10].

Определение числа  CTG-повторов проводили с использованием метода ПЦР [11].        Продукты амплификации разделяли электрофоретически в 8% денатурирующем полиакриламидном геле. Размер аллелей определяли с помощью контрольных образцов ДНК с известным числом повторов.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием компьютерной программы GenPop (version 3.3, 2001). Показатель генетического разнообразия рассчитывали по формуле [12]:

                     H=(1-∑x_i²)N(N-1),

где x_i – частота аллеля в популяции,  N – объем выборки.

 

Результаты и обсуждение

Клинико-генеалогический анализ семей с МД

К настоящему времени  в МГК-РБ№1 НЦМ РС(Я) и во время экспедиционных выездов в Амгинский, Вилюйский, Верхне-Вилюйский, Момский улусы проконсультировано 58 больных с клиническим диагнозом «миотоническая дистрофия» из 29 семей и 78 их клинически здоровых родственников из группы риска. 25 (43%) больным диагноз МД выставлен впервые при медико-генетическом консультировании семей с 2001 года. По этнической принадлежности все семьи с МД – якутские.

Возраст больных составляет от 14 до 53 лет, среди них 34-женщины, 24 мужчин. МД имеет широкую вариабельность в возрасте начала проявления симптомов заболевания, но чаще развивается в первом-втором десятилетии [5]. У 2/3 больных, консультированных нами, заболевание развилось с подросткового периода до 25 лет. В зависимости от возраста больных к началу заболевания и тяжести его клинических проявлений выделяют несколько форм МД. Слабая форма заболевания выявляется в среднем или пожилом возрасте и характеризуется наличием катаракты и отсутствием или минимальными мышечными нарушениями. Классическая форма проявляется в юности или во взрослом возрасте и характеризуется мышечной слабостью, миотонией, часто с катарактой, гонадной атрофией и ослаблением интеллекта. Наиболее тяжелой формой заболевания является врожденная МД. Эта форма часто приводит к смерти сразу после рождения, наступающей из-за респираторных осложнений. Некоторые авторы выделяют раннюю детскую форму МД, при которой характерны миотония и умственная отсталость. В нашей выборке большую часть исследованных составили больные, имеющие классическую взрослую форму (39 пациентов), в 16 случаях встречается классическая ювенильная форма, у 3 больных обнаружена ранняя детская форма. В 2 семьях в анамнезе у больных матерей были случаи смерти детей в первые сутки после рождения из-за дыхательных расстройств, что не исключает врожденную форму МД.

Наиболее часто встречающимися клиническими симптомами у обследованных нами больных являются: миотонический синдром (94,8%), слабость и мышечная гипо- атрофия (91,4%), катаракта (10,3%),  вегето-эндокринные  (раннее облысение, нарушения менструального цикла, бесплодие), сердечно-сосудистые нарушения.  Миотонические симптомы проявляются почти у каждого больного в виде активной миотонии (спазмы при попытке разжать кулак, открыть рот, свистнуть) и механической миотонии (симптом «ролика» или «валика», феномен I пальца). Гипотрофии мышц преимущественно выражены в жевательных, грудино-ключично-сосцевидных, в дистальных группах мышц конечностей. Отмечаются носовой оттенок голоса, затруднения глотания, поперхивание, различные психоневрологические отклонения, в тяжелых случаях интеллектуальная недостаточность. Характерен внешний вид больных: гипомимичное лицо, полуптоз век, запавшие височные ямки, полуоткрытый рот, у всех больных высокое твердое небо. Пациенты страдают от гиперсомнии, большинство имеет общую апатию.

При ЭМГ — исследовании у 36 больных в 89% случаев выявлялись миотоническая реакция и миопатические изменения, при ЭНМГ – в 100 % случаев снижение СПИ по локтевым, срединным и малоберцовым нервам.

Одним из серьезных осложнений, вызывающих существенную смертность при МД, являются сердечно-сосудистые нарушения. ЭКГ-исследование у 67% больных выявляет нарушения проводимости, брадикардию. У 2 больных (2,7%) выявлена AV-блокада. При анализе родословных в семьях, отягощенных МД, встречаются случаи внезапной смерти от сердечных нарушений.

Тип наследования при МД относят к нетрадиционным в отличие от классического менделевского наследования [6], некоторые авторы предлагают название аутосомно-динамического [9]. В 19 семьях (65,5%) МД наследуется по вертикали, подобно аутосомно-доминантному типу наследования, в  4  семьях у одного из родителей отмечена катаракта,   в 6 семьях родители, со слов больных, клинически здоровы. Наблюдается клинический внутри-, и межсемейный полиморфизм.

 

Особенности спектра нормальных аллелей гена МД  в якутской популяции

Популяционные исследования спектра нормальных вариантов числа CTG-повторов в гене МД представляют значительный интерес для познания причин, происхождения и распространения мутации, приводящей к возникновению болезни. Существует предположение, что удлинению подвержены повторы с n=5 и n>19, в то время как повторы с n=11-17 являются стабильными в ряду поколений [13,14]. Мы провели исследование нормального полиморфизма CTG-локуса у якутов на  выборке  из 134 человек.  Распределение частот CTG-повторов гена МД в популяции якутов в сравнении с  популяциями Волго-Уральского региона представлено на рис.1. В отличие от европейских популяций, где распределение частот аллелей имеет вид двухвершинной кривой, для якутской популяции характерно особое унимодальное распределение частот CTG-повторов с преобладанием аллелей с 12 и 13 повторами (76%) [15].

При сравнении с популяциями Волго-Уральского региона,  в которых показатель генетического разнообразия Н  варьирует от 0,739 у мордвы до 0,836 у башкир Илишевского района, у якутов выявляется  низкое значение Н (0,707), что характерно для народов, происходящих от небольшой по численности предковой популяции и  находившихся в условиях относительной изоляции в течение длительного времени.

Частота аллеля с 5 CTG-повторами, широко распространенного в европейских популяциях (до 40%), у якутов составляет 5%. Эти данные хорошо согласуются с результатами наших исследований полиморфизма митохондриальной ДНК [16], согласно которым содержание европеоидного компонента в генофонде якутов достаточно низкое – около 10%. Содержание нестабильных аллелей с числом повторов больше 19 у якутов составляет 5%, тогда как в различных популяциях это значение варьирует от 1 до 15% [17-21].  Таким образом, частота аллелей с нестабильными повторами сравнительно невысока. Накопление МД в якутской популяции, возможно, обуславливается  «эффектом основателя».  Это предположение требует дальнейших исследований по гаплотипированию мутантных хромосом.

Важной характеристикой полиморфного ДНК-локуса является показатель гетерозиготности. Фактическая гетерозиготность по CTG-локусу для  якутской популяции  составила 70%, для европейских популяций этот показатель варьирует от 70 до 91% [17,19,20].  В сравнении   с большинством  других популяций степень гетерозиготности по CTG-локусу у якутов более низкая. Тем не менее, при тестировании неродственных пациентов по данному участку гена МД более чем в 2/3 случаев должна выявляться гетерозиготность,  что позволяет использовать  этот подход  в ДНК-диагностике МД.

 

ДНК-диагностика МД  в практике  медико-генетического консультирования

В лаборатории Медико-генетической консультации НЦМ-РБ№1 с 2002 г. проводится молекулярно-генетическая  диагностика МД — определение гетерозиготности по участку CTG-повторов с применением ПЦР и электрофореза в полиакриламидном геле (рис.2) [21] . Высокий уровень гетерозиготности по  CTG-локусу в якутской популяции (70%) определяет эффективность тестирования.

Выявление двух аллелей гена МД на данном этапе позволяет исключить заболевание. В 31 случае у клинически здоровых родственников исключена МД – выявлена гетерозиготность по нормальным аллелям (обнаружены по два аллеля нормальной длины). У 69 исследованных (48 больных и 21 клинически здоровых родственников) при электрофорезе в ПААГ выявляется одна полоса. Этой группе в дальнейшем предстоит проведение ДНК-диагностики методом блот-гибридизации для определения размера экспансии  (количества СТG-повторов) удлиненного аллеля,  который не выявляется методом электрофореза в ПААГ. При отсутствии экспансии у здоровых родственников будет определяться гомозиготность по нормальному аллелю.

Этот подход применим также для дифференциальной диагностики МД, для постановки диагноза  при болезнях со сходной симптоматикой, например, при миотонии Томсена. В целях дифференциальной диагностики проведено ДНК-тестирование у 51 пациента. Определение гетерозиготности по участку CTG-повторов позволило  исключить диагноз МД  в  16  семьях.

Пренатальная диагностика на материале хориона проведена 4 женщинам, больным МД. В 3 случаях у плодов установлено унаследование патологического аллеля гена МД, по решению семей беременности прерваны.

В качестве примера приводим наше наблюдение семьи Р-вых, отягощенной МД.

Больной М., 43 года. Заболевание началось в возрасте 25 лет. Появилась слабость в руках, затем присоединились затруднения при разжимании кистей, сжатых в кулак, затруднение речи, спазм в жевательных мышцах. Наблюдается с диагнозом «дистрофическая миотония» с 32 лет. В семье 7 сибсов, из них больны 2 брата и 2 сестры, отец здоров, сибс отца умер от вилюйского энцефалита, мать считает себя здоровой, но при обследовании выявлены легкие миотонические симптомы. Две дочери пробанда страдают дистрофической миотонией  (Рис.3)

В неврологическом статусе – гипомимия, миотонические явления в виде затруднения при открывании рта, разжимании пальцев рук, сжатых в кулак. Речь дизартрична. Мышечная сила сохранена, сухожильные рефлексы оживлены, повышена механическая возбудимость мышц.

        Молекулярно-генетическая диагностика проведена в Санкт-Петербурге, обнаружены аллель нормального размера (13-повторов) и экспансия величиной  300 тринуклеотидных СТG-повторов, что соответствует классической форме МД и подтверждает диагноз «миотонической дистрофии».

Старшая дочь С., 20 лет. Наблюдается в МГК с 14 лет. Первые признаки заболевания появились с  6-летнего возраста, с возрастом наблюдается прогрессирование заболевания. Инвалидность с детства. Больная в динамике обратилась в МГК по поводу беременности. На раннем сроке проведена пренатальная ДНК-диагностика МД у плода, выявлено два аллеля с числом повторов 11 и 13, что свидетельствует об отсутствии мутации в гене МД. Ребенок осмотрен после рождения, клинически признаки МД отсутствуют.

Младшая дочь Л., 18 лет.

        Анамнез жизни. От  II беременности, протекавшей гладко. Роды в срок. Родилась с массой тела 3650 г, длиной 54 см. Период новорожденности протекал без особенностей. Психомоторное развитие соответствовало возрасту.

Анамнез болезни. Первые симптомы заболевания появились в 10 лет, когда появилась слабость в руках, ногах, повышенная утомляемость, изменение речи. Затем появились  спазмы в руках, в жевательных мышцах, боли в области сердца. Наблюдается с 12  лет, инвалидность с детства. Заболевание в динамике прогрессирует.

        Объективное исследование. Неврологический статус: Гипотрофия лицевой и жевательной мускулатуры, западение височных ямок, слабо надувает щеки. Выраженные миотонические явления при разжатии пальцев кистей, феномен I пальца. Речь дизартрична, гнусавый оттенок голоса, поперхивания. Выражена атрофия грудино-ключично-сосцевидных мышц, мышц конечностей, особенно дистальных отделов рук и мышц голеней. Мышечная сила значительно снижена, с постели встает с помощью миопатических приемов, голову от  подушки не отрывает. Сухожильные рефлексы с рук не вызываются, с ног – снижены.

Данные лабораторных и функциональных исследований. Биохимический анализ крови: сахар 4,7 ммоль/л, АлАТ 0,23 МЕ, калий 4,0 ммоль/л, натрий 141 ммоль/л, кальций 2,55 ммоль/л. Глазное дно без патологии. ЭМГ: миотонические разряды,  полифазные ПДДЕ, укороченные по длительности,  уменьшение амплитуды М-ответов по срединным нервам, снижение СПИ по большеберцовым, малоберцовым нервам. ЭКГ: Синусовая аритмия. ЭЭГ: легкие диффузные изменения. УЗИ: гиперплазия щитовидной железы, гипоэхогенные надпочечники, уплотнение стенки желчного пузыря. Заключение эндокринолога: латентная полиэндокринопатия (нарушение толерантности к глюкозе, гипотиреоз, хроническая надпочечниковая недостаточность). Кариотип 46, ХХ. Проведено молекулярно-генетическое исследование: обнаружен один аллель с количеством повторов 13.

У больной в сроке беременности 12 недель проведена пренатальная генодиагностика МД с использованием ДНК, выделенной из хориона. У плода выявлен один аллель с числом повторов 11, что свидетельствует об унаследовании нормальной аллели 11 от отца и удлиненного патологического аллеля от матери, т.е. выявлено наличие носительства мутации у плода. Семья приняла решение прервать  беременность.

Таким образом, в данной семье наблюдается клинический внутрисемейный полиморфизм, феномен антиципации, молекулярно-генетическими методами подтвержден диагноз МД,  проведена пренатальная диагностика.